ニューヨークのブルックリンで配管業を営むマリオとルイージの兄弟。ある日、マリオは地下で不思議な土管を見つけ、土管の中に吸い込まれキノコ王国へワープしてしまう。一方のルイージは、世界征服を企む大魔王クッパが支配するダークランドで囚われの身に。マリオは王国のピーチ姫と共に、クッパ軍団を迎え撃つため強力な兵力を有するジャングル王国へ向かう。しかし国王の息子で力自慢のドンキーコングと腕試しをするはめに…。